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一文get轉錄因子調控機制研究套路

眾所周知,ATAC-seq作為可以獲得全基因組染色質可及性圖譜、轉錄調控因子作用機制的高通量技術,是從表觀水平上研究疾病發生發展中轉錄水平調控機制的利器,那具體如何借助這一利器發現疾病發生發展中的關鍵轉錄因子,并揭示其調控機制呢?今天我們就通過這篇NC文獻get其中的經典套路。

研究背景

膠質母細胞瘤(GBM)是成人最常見的原發性腦腫瘤,由于不可避免地會出現浸潤細胞超出切除范圍,所以預后仍不理想。此外,腫瘤邊緣區的膠質瘤細胞的化療效果較差,并與腫瘤復發有關。考慮到浸潤邊緣腫瘤細胞相比于中心區細胞具有獨特的微環境和轉錄特征,這兩種細胞群可能受不同的分子通路調控。

表觀遺傳學對于正常干細胞發育和分化過程中的可塑性、維持異常癌癥干細胞狀態至關重要。在GBM中,染色質重構支持膠質瘤干細胞(GSC)發育過程的重現,促進腫瘤生長。研究已發現了在培養的GSC或患者來源的異種移植老鼠神經膠質瘤模型中與遷移和浸潤相關的轉錄因子(TF),如ZEB1、STAT324等。然而,由于浸潤性腫瘤細胞在其微環境中對運動性、黏附性、缺氧、代謝和免疫反應的復雜適應,這些TF在多大程度上調節腫瘤細胞遷移一直較難分辨。對直接從腫瘤灶分離的人類GSC群的TF進行分析,可以發現在培養細胞和混合正常腦實質的中沒有的調控遷移的內在調節因子。

在此,作者從人GBM和生發層(GM)組織中直接分離出GSC和神經干細胞/祖細胞(NSPC),基于ATAC-seq研究在相似的發育背景下腫瘤發生的內在轉錄調控因子及其調控機制。

研究方法
  • ATAC-seq

通過熒光激活細胞分選術(FACS)從GM和GBM組織中分離的細胞GSC(EGF+/-)、NSPC(EGF+/-),分別進行ATAC-seq。

  • 功能驗證實驗

CRISPR-Cas9基因敲除與過表達(TEAD1、TEAD4、EGFR等);RNA-seq;體外–細胞增殖與遷移實驗;體內–異種移植實驗;染色質免疫沉淀實驗等。

研究結果

GSC的全基因組染色質可及性特征

E – GBM在體外缺乏干細胞特性,在體內缺乏腫瘤發生機制,為了明確評估GSC中染色質可及性在發育方面的作用,將E+GSC和E+NSPC干細胞中富集peak與E- GBM相比較,發現了5020個差異peak,這些peak關聯基因進行功能注釋與富集分析表明這些基因與干細胞維持和增殖的生物學過程相關。作者對E+GSC與所有其他細胞群(NSPC與E-GBM)進行了差異可及性分析,以鑒定腫瘤干細胞表型特有的調控因子,發現了在腫瘤GSC中特異性富集的10509個peak,對應4015個蛋白編碼基因,它們與細胞遷移、運動和ECM過程具有顯著的相關性。在比較E+GSC和NSPC轉錄組時也發現了類似的功能基因集關聯。

基于ATAC-seq鑒定GSC中的關鍵轉錄因子

通過ATAC-seq分析染色質的可及性,不僅可以識別轉錄的調控區域,還可以推斷出其中的TF活性。在此,作者鑒定了27個GSC腫瘤特異性的TF motif,26個在E+GSC和E+NSPC中共有的發育相關TF motif。其中,TEAD1/4是具有很高活性的TF( motif是GSC特有peak中顯著富集,且基因表達水平高),其它候選TF包括ATF3、RFX1、FOXA1等。而E+GSC和E+NSPC中共有的發育相關TF包括SOX1、IRF3、NFIA等。然后,作者利用以前的類似的E+/E-GBM的RNA-seq數據,考慮到腫瘤特異性TF的基因表達水平,其中只有TEAD1在E+GSC中差異過表達。

此外,作者分析了所有TEAD家族成員(1-4)在TCGA數據庫RNA-seq數據中的表達水平,發現TEAD1是150個GBM樣本中表達最高的TEAD家族成員,且在蛋白水平上,TEAD1在PDX膠質瘤中表達。因此,TEAD1是GBM腫瘤中表達最高、表達最廣泛的TEAD家族成員。

TEAD1的功能性作用

在體外實驗中,利用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除TEAD1/4,發現KO腫瘤細胞系的增殖與遷移受到抑制,而過表達TEAD1/4后則可增強其調控作用,促進腫瘤細胞系的增殖與遷移。在體內實驗中,選擇體外抗遷移效果最強的TEAD1KO細胞系進行異種移植,發現腫瘤浸潤的面積和體積均顯著降低。總之,TEAD1是在GBM遷移中發揮重要作用的轉錄因子。

體外功能驗證

體內功能驗證

TEAD1調控的靶基因篩選

GSC中TEAD1可接近區域peak(ATAC-seq)和基因表達水平(RNA-seq)的一致性分析,結合GBM中TEAD1與基因共表達(TCGA中的GBM RNA-seq數據)分析,發現TEAD1的靶基因包括EGFR、AQP4、CDH4、TNC等多個候選靶基因。

作者利用不同亞型人GBM腫瘤樣本,通過ChIP-PCR對TEAD1的候選靶基因進行驗證。進一步結合TEAD1KO相比于對照的異種移植樣本中靶基因表達水平,EGFR、AQP4、CDH4在TEAD1KO樣本中表達下調,因此,TEAD1可能是通過結合靶基因EGFR、AQP4、CDH4調控其表達進而參與GBM遷移。

TEAD1調控靶基因參與遷移的機制

TEAD1KO異種移植樣本中EGFR的表達水平低于對照樣本,且TEAD1KO細胞系中EGFR表達相比于正常對照細胞系顯著下調,TEAD1過表達后EGFR表達有回升。對EGFR下游信號元件的表達水平的檢測發現,pERK在TEAD1KO細胞中下調,而pAKT則不同。TEAD1KO細胞經過較長時間的培養后,EGFR表達恢復,而遷移仍受影響。因此,TEAD1直接且短暫地調控EGFR

在對照和TEAD1KO細胞中過表達AQP4后,細胞的遷移能力提高了~ 50%,說明AQP4在GBM遷移中發揮了一定作用。且過表達TEAD1后不僅促進細胞的遷移,同時也上調了AQP4的內源性表達。因此,TEAD1和其下游靶基因AQP4的表達在促進原發性GBM細胞的遷移中存在直接的機制聯系。

小結

 

作者通過ATAC-seq繪制了膠質母細胞瘤干細胞(GSC)和神經干細胞(NSPC)的全基因組染色質開放區域圖譜,并結合轉錄組測序數據發現了在腫瘤細胞遷移中起關鍵作用的轉錄因子TEAD1,并通過細胞和異種移植模型水平上的TEAD1的敲除與過表達的體內外功能驗證實驗,驗證了TEAD1促進遷移的功能性作用。

作者通過ATAC-seq和轉錄組測序數據篩選出來TEAD1的候選靶基因,并進一步利用ChIP-PCR,驗證了與TEAD1結合的靶基因–AQP4、EGFRCDH4。TEAD1敲除使AQP4下調,TEAD1過表達可恢復AQP4的表達,而TEAD1和AQP4過表達均可修復TEAD1KO細胞的遷移缺陷,說明TEAD1作用于靶基因AQP4,調控其表達,進而參與GBM遷移的直接調控機制。

【文獻】

Tome-Garcia J, Erfani P, Nudelman G, et al. Analysis of chromatin accessibility uncovers TEAD1 as a regulator of migration in human glioblastoma[J]. Nature Communications, 2018, 9(1).

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https://international.biocloud.net/zh/article/detail/30275445

 

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