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基因定位解決方案之聯合分析

最近到了提交國自然的最后時期,小編猜今年一定還有老師想要申請——解析一個性狀的調控機制——這類課題,那這么大的課題,第一步我們要干什么呢?那肯定是獲得群體材料了,一般為全世界收集的核心種質資源材料組成的自然群體和雙親構建遺傳群體,那這些群體材料怎么用呢,這是老師們所關注的重點。

想要研究一個性狀的調控機制或一個生物學現象的原因,通常是先從基因定位開始,而其主流的三種方法是遺傳圖譜、混池分離分析(BSA)和全基因組關聯分析(GWAS)。通常三者之間可以聯合分析,又或是和轉錄組進行聯合分析,將定位區域縮小或候選基因的數目減少。

思路1、遺傳圖譜+GWAS

傳統的QTL分析是利用雙親得到的遺傳群體構建遺傳圖譜結合表型對目標性狀進行定位,這種方法主要依賴于雙親的遺傳多樣性,且QTL的檢測效果在不同群體間存在差異,同時有的定位結果可能比較大,包含了較多的基因,無法找到潛在的候選基因進行研究。而利用自然群體的全基因組關聯研究(GWAS)可以克服QTL分析的局限性,縮小候選區域,但GWAS假陽性比QTL分析高,因此兩者聯合可以在一定程度上彌補彼此的不足。

接下來就跟大家分享一遍辣椒遺傳圖譜和GWAS聯合分析的文章。

研究意義
辣椒堿是辣椒中一種獨特的化合物,它可以增強植株抗病性,同時具有良好的食用和藥用價值。

材料方法

材料:2個RIL群體(PD群體:120株;TH群體:85株)+1個自然群體(208份)

表型調查:利用高效液相色譜法(HPLC)測定辣椒堿類物質含量(辣椒堿、二氫辣椒堿和總辣椒堿)

1)‘PD’RIL和‘TH’RIL群體:分別進行3個和2個環境表型鑒定,為了減小果實大小的影響,均為取其果實的胎盤組織用于辣椒堿類物質提取。

2)GWAS群體:一年表型鑒定,冷凍干燥整個果實用于辣椒堿類物質提取,三次生物學重復。

測序手段:簡化測序(TH群體和GWAS材料)和重測序數據(PD群體)

技術路線如下:

主要結果

QTL定位結果:利用120個PD單株構建的重測序遺傳圖譜和3個環境下的56個單株表型數據定位到22個QTL位點。其中LOD值最高的是PD-dicap1.1 (LOD=8.7),表型變異率(R2)最高的是PD-dicap10.2 (28.8%)。同樣地,85個TH單株構建的簡化圖譜和2個環境的表型數據定位到22個QTL位點。其中LOD值(LOD=9.9)和R2(18.8%)最高的都是TH-cap2.2。兩者分析時均用CM334作為參考基因組,因此可以對2個群體的QTL定位結果進行比較,發現PD群體的9個QTL位點與TH群體的7個QTL位點的物理位置重疊。

圖1、QTL定位結果

GWAS結果:208份材料的簡化數據與一年表型數據進行GWAS分析定位到99個與辣椒堿顯著相關的SNP,分別對應69個block區,含有213個基因。

聯合分析結果:基于相同的參考基因組,通過比較QTL分析與GWAS分析的定位結果的物理位置發現GWAS結果中10個區域與本研究QTL定位結果重疊,查詢注釋結果,發現5個基因與辣椒素生物合成途徑相關基因。

圖2、GWAS定位結果

思路2、遺傳圖譜+轉錄組

轉錄組是通過研究多個樣品在不同時期和或不同組織部位之間基因表達的差異,從而找到與性狀相關的基因,但這種通常是全基因組范圍內且不能鎖定性狀相關區域。而遺傳圖譜可以鎖定性狀相關區域,但不能確定具體是哪個基因。結合轉錄組和遺傳圖譜,可以鎖定在某個區域內,某些基因或某個基因與性狀相關,用于后續驗證。

接下來就跟大家分享一篇高粱遺傳圖譜和轉錄組聯合分析的文章。

研究意義

氮是植物從土壤中吸收的最豐富、最需要的礦物質養分,往往是植物生長發育的限制因素。它是氨基酸、蛋白質、激素、葉綠素的重要組成部分。雖然氮肥的增加可提高糧食產量,但是其大量的使用不僅增加糧食生產成本,同時導致了環境問題,因為大部分的N流失到大氣中,通過淋溶作用加速了水體富營養化和土壤酸化,同時產生溫室效應。因此,如何提高作物的氮素利用效率(NUE)是科研工作者主要關心的問題之一。

材料與方法

作圖材料:CK60(氮敏感)和San Chi San(耐氮)雜交得到RIL群體,208個單株。

RNA-seq:雙親及2個混池(RIL中高、低NUE池,分別混5株),處理后3周時取根部

表型評價:2年2點重復試驗

田間條件:分別將雙親及RIL群體種植于低N田(LN)和正常田(NN);低N田供給的是N含量為0 kg. ha?1的合成肥,且用燕麥和玉米輪作耗盡其中的N素;正常田的供給的是N含量為100 kg. ha?1的無水氨肥,與大豆輪作補充N素。

表型鑒定:葉綠素含量、形態和產量性狀,共11個性狀

利用便攜式葉綠素儀測量營養期、開花期時第三片葉以及成熟期植株頂部向下6片葉的葉綠素含量(Chl1、Chl2和Chl3),均進行3次生物學重復;株高(PH):在生理成熟時從植株基部到穗尖的測量;花期(AD):統計50%的植株開花的天數;穗頭水分含量(MC2):收獲時測量鮮重,熱風機10-14d后測量干重,3株單穗鮮重和干重的差異(%)為MC2;秸稈含水率(MC1):方法穗部測量;生物量(BY):3株地上組織干重的均值;產量(GY):3株脫粒后粒重的均值;千粒重(TGW);粒稈比(GS,%):產量/生物量。

方法:Mapmaker/EXP 3.0和?IciMapping用于遺傳圖譜構建,WinQTLcart2.5用于QTL定位

主要結果

QTL定位結果:利用RIL群體構建簡化遺傳圖譜,含有833個SNP,總圖距為?1527 cM,平均圖距為1.8cM,結合11個性狀的2年2點表型數據進行QTL分析且作者將R2>10%的QTL為主效Q位點,最后得到32個QTL位點,6個與葉綠素含量相關的QTL,其中3個為主效QTL;14個與形態相關的QTL,其中7個為主效QTL;12個與產量相關的QTL,其中5個為主效QTL。

可靠QTL位點:9個主效QTL與本實驗室之前CK60/China17群體的的定位結果重疊,其中qAD-9在2個環境(LN和NN)下的定位結果一致。比較本實驗多個環境下定位結果,找到的2個穩定QTL,分別為qAD-9和qTGW-3,R2分別為9.2%和15%。這些均側面驗證了哪些是可靠QTL位點。

RNA-seq結果:雙親RNA-seq找到486個DEG,兩個RIL池的RNA-seq找到131個DEG,兩者取交集得到54個差異基因,認為這些基因可能與耐氮性狀相關的基因。

QTL定位與RNA-seq所用的參考基因組相同,從而兩者結果聯合得到2個基因(此處,作者寫的很含蓄~~~)。這篇文章就寫到了這里,但是我們可以看出后續作者會對2個主效QTL及這2個基因進行進一步驗證。

圖3、QTL定位結果

以上2篇文章都通過聯合分析找到了個位數的基因,并沒有做后續的驗證就發文章了,是不是很心動~~~

你也許會有疑問,怎么不見BSA的身影,因為篇幅的限制,這里并沒有寫,但是遺傳圖+BSA,BSA+GWAS和BSA+轉錄組這種思路當然也是可以的,但需要注意的是BSA最適合的是質量性狀(數量性狀的主效位點呢,可以是可以,但是表型調查要細心,誰讓數量性狀就是這么不讓人省心呢),而遺傳圖譜就不用注意這一點了,無論質量性狀還是數量性狀,它都能定位。

綜上給大家介紹的是聯合分析的策略來縮小區間,那是否還有其他的方法呢?當然有,想了解嘛?敬請期待下期…….

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